By Takeo Ogama

拍攝顯微螢光影像的過程需要很多參數微妙的平衡。一方面，您需要擷取一組亮度夠高的訊號，您可以藉由拉長曝光時間或提供更強激發能量來達到這個目的。另一方面，又必須減少激發能量照射的時間與強度，來減少對樣本的光毒害現象。讓我們一起來看看達到這微妙平衡的最佳做法。

1. 利用訊號強度分布圖

訊號強度分布圖可以幫助我們找出理想的曝光時間。簡單的說，訊號強度分布圖就是把照相設備所接收到的訊號強度繪製成而成的曲線圖。X軸代表訊號的強度高低，數值由零開始直到照相設備所能接收的最高強度。每一個訊號強度數字所顯示出來的高度代表此強度的像素點數目。請參考下方圖一：

圖一：影像的訊號強度分布圖。(a)原始圖 (b)在原圖中每一個像素點的訊號強度 (c)依據原始圖像素強度所繪製而成的訊號強度分布圖。

訊號強度分布圖所呈現形狀及強度分布方式可以讓我們知道目前的曝光時間是否恰當。在大部分的螢光影像中，大部分的像素都是沒有訊號的黑色背景，所以會有一條波峰落在強度較弱的背景區。在訊號強度分布圖中，若是大部分的訊號都落在強度較低的一側，表示曝光時間可能太短了 (如圖二中間圖)。若是有一段陡峭的訊號落在強度最強位置時，表示過飽和的訊號強度 (如圖二右圖)，這種情況下，可以降低激發的能量強度或是曝光時間。

圖二：左圖為正常曝光時間的訊號強度分布圖，中間為不足的曝光時間，左圖為過度曝光，黃色箭頭表示訊號強度飽和位置。

2. 調整影像顯示動態範圍以獲得最佳效果

有一些影像軟體提供自動顯示動態範圍的選項，這項功能可以加強訊號顯示效果但又維持原圖像數據的完整性，顯示的結果取決於訊號強度以及顯示亮度彼此之間的定義連結。如果將圖像顯示與訊號強度 (訊號強度指從背景直到最強的訊號值範圍) 的動態範圍做適當調整的話，可以提供更好的視覺顯示效果，並且不改變原圖像數據。訊號強度分布圖可以幫助執行這個調整功能。

圖三：顯示方式的調整。(a) 在原圖的原始設定下，影像顯示的最高亮度離實際強度太遠，導致顯示的影像亮度相當黯淡。(b) 調整過的結果。

顯微螢光影像拍攝六大步驟

接著請大家依照下列六大步驟練習拍攝顯微螢光影像的技巧 (請注意，最佳的拍攝參數設定可能會依據你的實驗應用或機器配置而有些許差異)
1. 決定要觀察的鏡頭倍率。
2. 調整焦距並尋找適當的目標位置。當使用相機尋找時，記得將自動顯示調整功能開啟，以便得到最佳的影像結果。並請記得，當你不進行觀察或沒有拍照的時候，隨手將螢光遮光板關閉，以避免樣本螢光漂白或是產生過多光毒害現象。
3. 設定影像擷取的相機設定 (如:影像尺寸，曝光時間……)
4. 從較弱的螢光光源強度輸出開始調整拉長曝光時間，直到訊號強度分布圖能明顯分出背景值及訊號值。
5. 若是曝光時間必須要拉很長的話，試著逐步加強螢光光源強度輸出。
6. 由訊號強度分布圖確認沒有過度曝光的訊號值。
有機會的話，練習一下這兩種技巧及六大步驟，可以讓你的螢光影像更加光芒耀眼喔。若需要進一步的資訊，也可以參考我們的進階白皮書: 探討數位影像結果與樣本之間的關聯。

拍攝螢光影像時要好好評估實驗樣本及應用

好的螢光影像最終還是取決於您的樣本及實驗應用類型。若是較脆弱的樣本，就要將螢光光源強度降低。換言之，若要拍攝較快速的現象，使用較強的螢光光源及較短的曝光時間可能比較適當。無論哪一種樣本及應用，訊號強度分布圖以及影像顯示調整都可以幫我們得到較為理想的影像拍攝條件。