By Joanna Hawryluk

我們生活在瞬息萬變的三維世界，以目前的顯微技術而言，觀察快速變化的活體影像仍是一個很大的挑戰，與其他的光學顯微鏡技術相比，螢光顯微鏡雖然擁有優異的影像解析性以及對比度，不過仍然受限於影像的訊噪比以及光毒害效應。
眾所周知的共軛焦顯微鏡，就是利用針孔消除了焦平面以外的離焦影像，這樣的技術雖然達到光學切片的目的，並且提升了訊噪比，然而樣品必須反覆暴露於大量激發光線之中，如此必定增加了光毒害、光漂白的可能性。

層光顯微鏡的問世

在上世紀初期1900年代，科學家們開始尋找一種提升生物影像的有效方式，大約在1902年間這股新科技浪潮來臨，Richard Zsigmondy and Henry Siedentopf 共同開發出新型顯微鏡名為 「Ultramicroscope」。其設計擺脫了傳統的設計方式，是以正交垂直方式將照明光路及成像偵測光路分離，這是層光顯微鏡最早的雛型。
大約100年後，Voie et al.利用這項技術進行幾內亞豚鼠光學切片掃描，進而發表了全球第一次層光顯微鏡 (light sheet microscope) 的影像。到了更近期，各式各樣的層光顯微鏡不斷被開發出來，其應用層面包含細菌族群、果蠅、斑馬魚、以及各式各樣的組織結構上。

層光顯微鏡世代來臨

當代的LSFM系統，也稱為擇面光顯微鏡Selective Plane Illumination Microscopy (SPIM)，設計方式如同過去一樣採用了正交垂直架構，再加上柱面透鏡產生出薄面光進行光學切片。這薄面光透過物鏡焦平面範圍在樣品的子區域有效激發出螢光，再搭配高速sCMOS相機來擷取螢光影像。
相較於傳統的共軛焦顯微鏡，LSFM可以提供範圍更大的影像取樣深度，並且提升了訊噪比，快速的拍照速度大大減少了光毒害的效應。如今層光顯微鏡已經被公認是拍攝全組織、活細胞樣品最主流且關鍵的顯微技術，然而在科學界這項技術的發展，仍然被現有的實驗模型相當程度地阻礙下來。
近年來，市面上出現了各式各樣的LSFM系統，每一台系統的功能皆不盡相同，因此如何針對實驗需求來挑選適合的系統，將會是科學家、研究人員重要的課題之一。

比較層光顯微鏡的四個要點

選擇層光顯微鏡有幾項重要的考量要素。

• 首先，最重要的是樣品備製 : 傳統顯微鏡通常需要將大樣品進行切片後固定在玻片上，而層光顯微鏡使用前必須將樣品做澄清化處理，讓樣品變得透明。市面上有多家組織澄清液品牌，並且提供相對應的使用程序給研究人員。在此建議參考“A beginner’s guide to tissue clearing” by Pablo Ariel (Int J Biochem Cell Biol. 2017 Mar. 84: 35–39)，文中介紹了多種常用的方法。
• 光路架構 : 層光顯微鏡系統的照光和影像擷取光路架構，對於樣品的成像品質和能見視野有著重大的影響。舉例來說，激發光照射樣品中的不透明結構，將會在影像中形成條狀紋路。為了解決這個問題，各大廠商皆嘗試開發符合各種活體樣品大小，以及適合澄清化樣品的顯微光學架構，多向式擇面光顯微鏡(mSPIM)就是一個例子，mSPIM應用多向照明技術有效地克服了影像的條狀紋路。雖然mSPIM在特殊的生物樣品應用上有不錯的表現，但是整體系統的活用性、模組化和實際使用程度上依舊被侷限著，因此在選擇適合的系統時，應該多方考量以上要點。

• 樣品靈活性 : LSFM是一個快速發展的顯微技術，幾乎每年都有新的系統投入市場，因為各家設計不同，可以容納樣品的大小、型態也有所差異。有些系統只能對較小樣品進行成像(例如細胞球體)，另一些系統只能對於較大組織進行拍攝，又或者這些系統僅限使用於固定樣品或活體樣品，這樣高專一性的系統或許可以滿足一種樣品型態的使用者，但假若這系統是在公共儀器室，或是提供整個研究部門使用的話，那麼系統所能提供的效能將會大大折扣，因此最重要的是必須考量到您的LSFM系統對於樣品的適用程度。近期OLYMPUS發表了Alpha3 LSFM，補強了不同實驗模型的需求，研究領域可以從單一細胞到整個小鼠大腦，應用範圍更加便利、靈活。
• 最後的一項關鍵重點就是影像大數據的管理。LSFM在完成一項實驗後，所產生的資料量往往是數十GBs，甚至可能到TBs等級，這樣的資料量是一般電腦系統無法承受的，建議您與元利儀器的專員聯繫，我們會提供您最適當的大數據管理系統。另外，關於影像分析軟體，我們的專業團隊也會協助您建立有效的且完整的方案。