By Rebecca Bonfig

共軛焦顯微鏡檢測原理

雷射掃描共軛焦顯微鏡是檢測細胞和組織中蛋白質表達及相互作用的經典技術。與寬場落射螢光顯微鏡相比，共軛焦顯微鏡利用與焦平面共軛的針孔，極大地降低了焦平面外雜散光的干擾，從而獲得組織焦平面光學切片圖像。共軛焦成像方法能夠有效實現對厚樣本的清晰、高解析度成像，但是針孔的固有光損耗極大地降低了其圖像的信噪比。因此，提高顯微鏡光學系統的光效率，並盡可能減少雷射強度，同時盡可能檢測到更多的發射光信號，是提高圖像信噪比的關鍵所在。

濾光片和光譜檢測技術的差異

早期的共軛焦顯微鏡只能使用簡易濾光片檢測螢光，通常情況下，需要將一個帶通濾光鏡放置在檢測器光電倍增管（PMT）前，用以篩選進入檢測器的光的波長。隨著技術的發展，新型共軛焦顯微鏡開始利用光柵或棱鏡獲得發射光的光譜，對一個或多個檢測波段進行精確調節，實現“萬能濾色片”的光譜檢測功能。使用光譜檢測，您還能對整個發射光譜實現特定頻寬和步進的“光譜掃描”，獲得標本發光譜曲線資訊，並能特異性地去除背景自發螢光或拆分串色信號。因此，基於光譜的檢測方法極大地提高了實驗的靈活性，成為共軛焦顯微鏡的主流配置。

共軛焦顯微鏡光譜檢測的起源

光譜檢測技術最初採用反射式衍射光柵和棱鏡系統這兩種方法實現。反射光柵技術在20世紀90年代末首次被應用於商業共軛焦顯微鏡（圖1）。此後不久，基於棱鏡的共軛焦系統也開始出現。光譜檢測技術雖然帶來了靈活性，但與濾光鏡的方法相比檢測效率稍低，特別是反射光柵的光損耗更高，主要由以下三點原因造成：
高階衍射損耗：光被衍射光柵反射時會產生多階衍射。由於只有一級衍射可被檢測，因此高階衍射均被損失掉了。
偏振相關損耗：光的反射率與其偏振態相關，對於反射光柵而言，p偏振光的衍射效率要低於s偏振光的衍射效率。
反射光柵效率的波長依賴性：反射光柵的衍射效率在特定波長達到最大值，而在較高或較低波長的效率則會更差。
受這三個因素的影響，反射光柵是光譜檢測方法中效率最低的。基於棱鏡的檢測方法雖然克服了高階衍射光損耗的問題，但是在更長波長下的光譜解析度會降低，且光譜分光精度不均勻非線性。這些缺點使得這兩種技術均無法完全取代對濾色鏡檢測系統的需求。

 圖1：共軛焦顯微鏡光譜檢測技術的發展

體相全息透射光柵：一種別出心裁的光譜檢測方法

近二十年來，反射式衍射光柵和基於棱鏡的技術成為共聚焦顯微鏡製造商實現光譜應用的首選。然而，顯微鏡並不是唯一使用光譜學作為成像手段的領域，天文學亦是如此。與顯微鏡類似，由於天文物體（如星系和其他天體）會發射從紫外到紅外的光線，天文學家需要通過區分這些光線的成分以獲得它們的準確圖像。（圖2）

圖2：光譜學在天文學中用於構建銀河系圖像。
圖片致謝：NASA，ESA，Dan Maoz（以色列特拉維夫大學和美國哥倫比亞大學）

天文學家在其中所使用的關鍵技術之一就是體相全息透射光柵（Volume Phase Hologram，VPH）。與通過反射光線產生光譜的表面浮雕光柵不同，體相全息光柵使用的是透射方法，讓光線通過光柵將入射光衍射成光譜（圖3）。使用體相全息光柵的天文學實驗最早發表於2000年左右，隨後該項技術得到迅速推廣。現在，世界上一些大規模的實驗室已經成功地將超大型的體相全息光柵應用於光譜學研究上。

圖3：反射光柵和透射光柵的橫截面

表面浮雕光柵（左）將光線從光柵表面反射，而體相全息光柵（右）讓光線透射
在共軛焦領域裡，奧林巴斯於2016年推出了具有TruSpectral™專利檢測技術的FV3000共軛焦系列。TruSpectral技術使用體相全息進行透射式光衍射的，這也是體相全息技術首次應用於商業顯微鏡。
在顯微鏡中使用體相全息光柵具有諸多優勢：

• 低偏振靈敏度
• 低散射率（高效率）
• 高光譜透過率（與反射式衍射光柵相比，紅色波段尤其突出）
• 應用比濾色鏡更靈活

得益於透射光柵的引入，TruSpectral技術成功克服了許多與常規光譜檢測的難題。例如，與反射光柵相比，透射光柵不僅偏振相關損耗極小，還消除了波長對衍射效率的影響。通常情況下反射光柵的角度固定，只能針對一個波長進行優化，而體相全息光柵的角度可以自由調節，能夠優化任意波長的效率。
因此，使用透射光柵的共聚焦顯微鏡，不僅在全光譜範圍內實現更高的光透過率，特別是在紅光、近紅外光和遠紅外光波段透過率提高三倍。

FV3000共軛焦顯微鏡體相位全息光柵的工作原理

FV3000共軛焦TruSpectral專利檢測技術使用的體相全息透射光柵具有三大特點（圖4）：

• 體相位全息透射光柵的角度電動可調，根據檢測波長自動優化角度
• 通過電動旋轉反射鏡可將體相全息光柵產生光譜的特定區域對準檢測器（光電倍增管）的靶心，以實現最大效率檢測
• 檢測器前端的可調狹縫可在1 nm至100 nm之間以1 nm步進自由調節，靈活調節檢測波段

這些功能的組合即可實現從400 nm到800 nm的高解析度高線性光譜成像和光譜掃描。

圖4：FV3000共聚焦顯微鏡基於體相全息的TruSpectral檢測系統原理圖

TruSpectral技術對紅色螢光染料成像的優勢

體相全息透射光柵不僅提高了靈活性，還大幅度提高了檢測系統的透射率，這一點在紅色到遠紅色窗口尤其突出。（圖5）
由於近紅外的光毒性較小，能夠更好地穿透組織，還擴展了多重螢光標記能力，因此紅移染料在成像應用中日益普及。但由於反射光柵和棱鏡的透射率和光譜解析度較差，使用傳統的光譜成像技術很難對紅色螢光進行成像。基於體相全息透射光柵的光譜檢測不僅可以實現更高的紅光透射率，同時確保光譜的精度和解析度，將高達1 nm光譜解析度一直擴展到800 nm。

圖5：FV3000顯微鏡基於體相全息透射光柵的TruSpectral檢測技術與FV1200顯微鏡基於反射衍射光柵的光效率對比。與傳統的光譜檢測方法相比，使用體相全息透射光柵可以將透射率提高多達3倍。

體相全息透射光柵的改進讓我們將FV3000共聚焦顯微鏡設計打造成為全光譜成像系統，這意味著如圖4所示，每個檢測器都使用基於體相全息透射光柵的TruSpectral檢測技術。配合Lambda掃描模式，可對複雜重疊的螢光信號精確進行光譜掃描和拆分，保證每種螢光信號的準確性。（圖6）
此外，由於每個獨立通道都可靈活調節檢測波段，獨立調節檢測器的參數，讓您能夠拆分多個不同強度的信號，更好地同時檢測亮和暗的螢光。 

圖6：COS-7細胞的光譜掃描模式可清晰拆分螢光高度重疊的信號

從天文學到顯微鏡，體相全息透射光柵正在逐步成為光譜實驗的強大工具。奧林巴斯FV3000共軛焦獨有的TruSpectral技術，清除多色成像中螢光信號串擾的“絆腳石”，助您獲取準確明亮的多色螢光圖像。 接下來的發展如何，讓我們拭目以待！

（上）一個星系內不同天體所發出光線的光譜分離。（下）一個細胞內四個不同結構的光譜分離。
圖片致謝：NASA，ESA，Dan Maoz（以色列特拉維夫大學和美國哥倫比亞大學）