By Dr. Gulpreet Kaur

近年來層光顯微鏡系統（LSFM）在市場上推陳出新，引領我們進入生命科學影像的創新時代。過往研究人員所使用的傳統組織切片方法已過時，如今科學家可以透過LSFM，輕而易舉地獲得生物個體和完整組織的快速即時影像，這無疑是個劃時代創舉。這篇文章將探討有關層光顯微技術的各個面向，包括運作原理、關鍵優勢，以及5種突破生命科學研究極限的方法。

為何要使用層光顯微鏡？

層光顯微鏡使用「薄光技術」而非傳統光點來激發局部樣品，其經由垂直於照光系統軸的收光物鏡，可以有效收集螢光訊號。 這種光路設計常稱為「擇面光顯微術」（SPIM），由於此方法僅激發視場（FOV）中的螢光團，並且不會受到離焦訊號干擾，因此在被照射的平面上可以有效形成光學切片。在產生立體成像時，此技術的空間分辨率較佳。因此可以依次照射在每個平面上來形成3D堆疊影像。如此可以減少樣品中螢光團的能量負荷，從而減少了光漂白和光毒害作用。

傳統顯微鏡在生物影像的3大挑戰

相較於傳統顯微鏡，層光顯微鏡系統擁有更多優勢，可適用於不同實驗，我們彙整了生物影像領域的三大挑戰：

1. 大型樣品不易建構3D影像資料 : 過去針對較大樣品（例如小鼠的整個器官）的成像技術，涉及實際器官切片，並需系統性整合所有獲得的影像資料，才得以重建整個器官的立體影像。此外，為了有效控制樣品型態，勢必會遺失那些可以定量處理的資料。

2. 成像速度慢、激發效率低：先前的部落格文章提及，共軛焦顯微鏡的解析度高，但是成像速度和激發效率低。光學切片是藉由針孔光圈（pinhole）而形成，整個樣品在Z軸平面上會被多次照射，將可能導致光漂白現象。另外，共軛焦顯微鏡一次只掃描樣品上的一點，因此3D影像的建構時間很長。若想提升共軛焦顯微鏡的成像速度，可使用共振掃描鏡組、GaAsP光電倍增管，或是轉盤式共軛焦顯微鏡。然而，掃描速度變快，意味著螢光訊號的激發量降低，導致信噪比也隨之降低。共軛焦顯微鏡和旋轉盤式共軛焦顯微鏡都適用於一定厚度的組織切片，或是長時間觀察活體樣品，但對於較深層組織樣品的成像不佳。

3. 設備投資較昂貴 : 利用多光子成像技術，可獲得高解析率的深層影像，但此技術十分昂貴，並且需要很長時間才能得到大組織影像。近年來，科學家對於低光毒性的3D活體影像需求不斷增長，2004年Husiken等人建立第一台以SPIM為核心技術的層光顯微鏡系統，其目的是用於研究稻田魚與果蠅胚胎的生長過程。如今，層光顯微鏡十分受到科學家喜愛，並且廣泛應用於生命科學研究領域。

層光顯微鏡在生命科學研究領域的五項創新應用

小鼠大腦神經網路成像

如今有不少實驗室正在使用層光顯微鏡，針對模式生物（例如小鼠）大腦中的整個神經元網路進行成像。小鼠大腦影像已經過透明化處理（去除不透明的脂質和蛋白質顆粒），並且標記了神經元蛋白c-Fos。使用LSFM系統，不用透過影像擷取之後的重建程序，就可以得到完整的大腦影像：這種方法可用來定量影像中的各類參數，例如神經元長度、神經元分支點的數量，以及神經元網路中樹突棘的數量。另一項研究也值得關注：2007年，Dodt等科學家使用了結合雙向照明擇面光顯微術的層光顯微鏡來成像整個小鼠大腦。他們清楚拍攝出海馬迴在整個大腦中的分佈和細節。此外，他們可以清楚辨識海馬迴中的神經元細胞和樹突棘，並建構出錐形細胞的複雜網路。在放大20倍時，他們還可以識別出樹突棘，因此推展了神經學領域的重要研究：

• 樹突棘的結構相當複雜，在學習過程中會受到許多因素影響，並且已知樹突棘密度會因為許多神經系統疾病（例如自閉症、X染色體脆折症、阿茲海默症）而改變Chidambram等人，2019年）。
• 如今科學家可以仔細分析和研究小鼠大腦神經元網路中的樹突棘密度與其他參數，並與疾病模型詳加比較，從而讓我們更加了解各種神經系統疾病（Dodt等人，2015年）。

使用層光顯微鏡，也有助於研究活化神經元的分佈，以及神經元所驅使的行為反應（例如恐懼）。神經元群體參與大腦中恐懼記憶的形成、維持和表達（Kim等人，2015年）。目前，核磁共振造影（fMRI）常用於確認各腦區所參與的功能，但由於技術限制，核磁共振造影的解析度無法達到細胞層級（Dodt等人，2015年）。隨著擇面光顯微術的創新發展，如今可以在標記早期基因活化轉錄標記物（例如c-Fos）的情況下，成像出完整的小鼠大腦，從而辨識大腦各區塊的功能（Kim 等人，2015年）。

整體器官的血管分佈成像

LSFM的其中一項關鍵應用，是將模式生物（例如小鼠）的完整器官或腫瘤的血管分佈視覺化。器官中的血管系統結構，可以藉由影像分析而得到量化參數，例如血管流量變化、血管長度標準（normalized vascular length），以及微血管的平均直徑。血管體積和長度是血管密度的指標，而血管密度和長度會在各種情況下發生變化，例如血管損傷、局部缺血或血管新生。在某些疾病（例如中風）的生理表現中，也可以看到血管的直徑不斷改變。為了將整個小鼠大腦中的微血管結構視覺化，Jährling等人在2009年採用了雙向照明層光顯微鏡（或稱為dSPIM）。在小鼠大腦的內皮細胞使用來自番茄Lycopersicon esculentum，LEA）的番茄凝集素與FITC螢光染料進行染色。他們之所以使用LEA，是因為它主要會標記微血管的內皮細胞，而對於較大分支血管的染色程度較低。若小鼠大腦影像標記了凝集素，便可以觀察到微血管網路裡最細微的分支結構。另外，他們還獲得了脊髓和心臟心房的影像，其中可觀察到由微血管迴圈形成的心房微血管結構。

此方法廣泛應用於癌症研究，因為腫瘤需要大量的血管增生才能生存（Dodt等人，2015年）。在神經生物學領域中，可以透過大腦血管系統相關研究找出血腦障壁形成缺陷的位置。血腦障壁受多種神經系統疾病影響，例如阿茲海默症，帕金森氏症，肌萎縮性脊髓側索硬化症（ALS）和多發性硬化症（Eredener Dalkara，2019年；Boero，1985年）。

活體腦部中的鈣離子影像

鈣離子會產生多種細胞內訊號，這些訊號參與生物體內多種功能的行使，包括基因轉錄、細胞週期、心肌收縮和神經傳遞物質釋放（Grienberger Konnerth，2015年）。

使用傳統顯微鏡方法進行鈣離子影像擷取是十分有挑戰性的，因為這些動態行為的發生速度很快。雖然共軛焦和多光子顯微鏡具有良好的空間解析度，但也因此犧牲了成像速度。另外，由於畫素取樣不同步，因此可能在重建影像的過程中失真或是產生假訊號。（Pham等人，2020年）。

近年來，研究人員們紛紛投向層光顯微鏡的懷抱，藉此克服以下這些挑戰。

例如在2020年，Pham等人使用Alpha3層光顯微鏡，研究活體小鼠腦切片中星形膠質細胞的鈣離子動態變化（參見下圖1）。他們使用洋菜膠固定鼠腦冠狀切片，並置放在顯微鏡樣品艙中，觀察到靜止狀態下皮質和下丘腦星狀膠質細胞之間的鈣離子動態差異，以及對GPCR活化的反應，這代表此處有獨特且異質的亞群存在，且具有不同的功能和分子特性。

圖1. 螢光觀察法（EPI）和Alpha3層光顯微鏡觀察小鼠腦切片中星形膠質細胞的鈣離子訊號影像。

這也代表明星形膠質細胞在大腦發育和功能調節的重要性，過去科學家認為星形膠質細胞僅影響神經組織（Grienberger Konnerth，2015年）。這個例子正好可以說明，使用LSFM可快速觀察厚組織中細胞的活性指標，以及拍攝3D立體影像（Hillman等人，2019年）。

獲取活體硬骨魚類視覺區發育的影像

硬骨魚類模式生物因其身體外部呈透明狀，非常適合即時影像擷取，因而常用來研究動物型態發生的相關研究。例如，Devos等人在2019年使用Alpha3層光顯微鏡，比較了兩種變種麗脂鯉（地表居和穴居）在眼睛的形態發生過程，並且藉此探討發育過程中形態和模式形成的差異。該研究的目的在於檢視這些洞穴魚的缺陷，以及眼部形態發生的機制。在研究生物發育的過程上，層光顯微鏡在許多技術層面都具有優勢。Alpha3層光顯微鏡系統使用了動態範圍較廣的CMOS相機，可以有效偵測到終腦中的強螢光標記，和眼睛區域的弱螢光標記。此外，正交雙向架構的照明技術可產生較好的空間分辨率，可以將雷射光保持在較低的強度，以避免造成嚴重的光毒害，另外，即使對脆弱的活體胚胎進行了超過20小時的影像拍攝，在胚胎受精（hpf）後的48至60個小時，仍可發育成正常的頭部形態（參見下圖2）。這項研究顯示，層光顯微鏡可滿足生物學家長時間記錄生物發育過程的需求，同時將光毒害的影響降至最小（Wan等人，2019年）。

圖2. 居住於地表的魚（SF）和洞穴魚（CF）的活體即時影像，用於研究眼睛的形態發生。

活體斑馬魚器官的高速成像

正如先前所提，相較於轉盤式共軛焦或雷射掃描共軛焦顯微鏡，LSFM提供了更加顯著的時間解析度。利用這樣的優勢，Lee等人在2006年成功對活體斑馬魚的胚胎心臟進行了螢光影像拍攝。由於斑馬魚的心臟尺寸相對較大（約為250μm），且心跳速度快（2至4 Hz），不易透過傳統成像技術擷取影像。若想用過往的光學技術達到這樣的成像速度，只能擷取單一個XY平面影像。因此在LSFM技術發表以前，要對心臟進行完整且準確的功能分析，一直是個艱難的挑戰。（Yalcin等人，2017年）。為了以高解析度準確追蹤跳動心臟的心肌壁形變和紅血球細胞（RBC）的流動，我們對RBC和心肌進行了螢光染色。這樣可以有效評估斑馬魚模型中的小樑形成（trabeculation）的時間週期，並建立觀察剪應力活化時如何增進小樑形成的機制。斑馬魚、雞類、小鼠和人類胚胎的小樑型態發生是相當緩慢且保守的，因此這些研究可能會產生相當深遠的影響。