By Dr. James Lopez

雷射掃描共軛焦顯微鏡是一種被廣泛使用的生物學研究工具。由於具有良好的色彩分離能力，因此通常被用來對多種螢光探針進行同步成像，當然，生物學家也經常利用其強大的Z軸解析度對生物樣本內部進行深層成像。
現在，雷射技術的創新助推共軛焦顯微鏡在生物學領域的應用，讓更複雜的生物學實驗成為可能。在本篇文章中，我們將討論FV3000共軛焦顯微鏡新型近紅外（NIR）雷射如何協助複雜多色同步成像的熱門實驗應用。*

共軛焦顯微成像中5+通道多色同步成像的門檻及解決方法

讓我們首先介紹一下複雜多色同步成像實驗的歷史。多年來，許多研究人員使用DAPI和其他兩種顏色（通常為綠色和紅色）進行免疫螢光。隨著抗原抗體免疫和成像系統的發展，通過使用更多檢測器和更出色的發射光濾波技術，四色免疫螢光成像開始流行。DAPI、綠色、紅色和遠紅色是最常見的四色組合。然而，在使用第五個通道時，兩個關鍵因素造成了問題。

1.缺乏具有良好光束品質的NIR雷射二極體。

首先，具有良好光束品質的NIR雷射二極體尚未在共軛焦掃描顯微鏡中普及。共軛焦成像所用雷射二極體需要具備足夠大的功率（但不要太大）、極小的功率波動以及可相容的光束輪廓三個必需特徵。但是，直到最近幾年，在近紅外波長範圍才有少數NIR雷射二極體可供選用。
但最新的雷射二極體技術讓這種情況發生改觀。我們的FV3000共軛焦顯微鏡現在提供可有效激發第二種染料的730 nm和785 nm雷射二極體，這些染料例如：

• Cyanine7 (Cy7)
• Alexa Fluor 750
• Alexa Fluor 790
• DyLight 800
• IRDye 800
• Indocyanine green（ICG）

這些染料以及越來越多的新螢光探針讓添加第五和第六通道進行多色同步成像更具吸引力。

2.光電倍增管檢測器在NIR波長上的檢測靈敏度降低。

第二個問題是，很多光電倍增管（PMT）對於730 nm和785 nm激發的螢光波長的檢測靈敏度降低。
對於常用的磷砷化鎵光電倍增管（GaAsP PMT）而言（其對可見光譜中間部位的波長具有更高靈敏度），對於近紅外光檢測範圍靈敏度的降低特別突出。在750+ nm範圍內，GaAsP PMT檢測器的靈敏度非常低。
為了克服這一難題，我們將紅移GaAs檢測器集成到FV3000共軛焦雷射顯微鏡中。

現在，我們的FV3000系統可提供包括光電倍增管和GaAsP PMT在內多種不同組合的GaAs檢測器。這些配置可以將GaAs檢測器作為複雜應用實驗的第五或第六通道使用。
結合我們的X Line高性能物鏡，FV3000系統就可以實現從400–1000 nm的高品質寬色差校正。這樣就可以在明場和多色螢光成像過程中獲得更好的色彩還原。